Dołącz do czytelników
Brak wyników

Laboratorium

29 marca 2019

NR 32 (Marzec 2019)

Enzym spod ziemi - Paroksydaza

0 54

Enzymy dawniej nazywane fermentami stanowią jedną z podstaw tego fascynującego – i dosyć ważnego nie tylko dla biologa – zbioru zjawisk fizykochemicznych tworzących materialną stronę fenomenu nazywanego przez nas życiem. Ich rola jest nieoceniona, ponieważ bez udziału tych substancji właściwie niemożliwe byłoby prowadzenie przez organizm reakcji metabolicznych, a więc przemiany materii i energii.
Działem biochemii zajmującym się enzymami jest oczywiście enzymologia. Bada ona strukturę tych substancji, ich właściwości, mechanizmy działania, funkcje, biosyntezę oraz sposoby ekstrakcji i oczyszczania. Ma to duże znaczenie choćby z punktu widzenia medycyny, ponieważ zaburzenia w pracy enzymów są często powodem chorób.
Swoistość katalitycznego działania enzymów jest bardzo zróżnicowana. Jedne z nich reagują tylko z określonym związkiem (oksydaza glukozowa utlenia praktycznie tylko D-glukozę), natomiast działanie innych jest możliwe np. w całej grupie podobnych substancji chemicznych. Do tej drugiej grupy należą peroksydazy, których działanie postaramy się zbadać praktycznie.

Materiał

Najlepszym źródłem peroksydazy do doświadczeń będzie korzeń chrzanu pospolitego (Armoracia rusticana) z rodziny kapustowatych (Brassicaceae) [fot. 1A]. W razie jego braku można wykorzystać też korzeń pietruszki zwyczajnej (Petroselinum crispum) należącej do selerowatych (Apiaceae) [fot. 1B].
Obie rośliny są wykorzystywane w sztuce kulinarnej, a więc z ich zdobyciem nie będzie problemu. Nabycie korzenia chrzanu w miesiącach zimowych jest nieco trudniejsze, możemy się jednak wtedy posiłkować pietrusz­ką dostępną w sklepach przez cały rok (trzeba się wtedy jednak liczyć z nieco słabszym wynikiem prób).
Do wszystkich doświadczeń używać należy – o ile nie zaznaczono inaczej – surowych, nie poddanych obróbce termicznej tkanek korzeni.

Fot. 1. Przykładowe źródła peroksydazy; A – korzeń chrzanu pospo litego,
B – korzeń pietruszki zwyczajnej

 

Ku przestrodze

Pamiętając, jaką przyjemność daje samodzielne eksperymentowanie, nie możemy zapominać o możliwych zagrożeniach – szczególnie że tym razem będziemy stosować wiele substancji, które z tego czy innego powodu mogą być niebezpieczne. Benzydyna i jej pochodne (także o-tolidyna) jest silnie toksyczna i rakotwórcza, o podobne właściwości podejrzewa się także luminol i fenoloftaleinę. Roztwory wodorotlenku sodu, nadtlenku wodoru i kwasu octowego o odpowiednio dużym stężeniu są żrące i mogą powodować trwałe uszkodzenia ciała w razie bezpośredniego kontaktu. Ten ostatni posiada także przykry duszący zapach i wykazuje trujące działanie przy ekspozycji na inhalację. W przypadku silnie rozdrobnionego metalicznego cynku zagrożenie jest odmiennej natury, ponieważ może on być łatwopalny – w kontakcie z pewnymi utleniaczami [np. z azotanem(V) amonu] substancja ta ulega wręcz samozapłonowi. 
Osobną sprawą jest bezpieczeństwo przy podgrzewaniu nawet niewielkich ilości substancji, szczególnie żrących – trzeba to robić ostrożnie i delikatnie, np. ujście probówki nie może być skierowane ku ludziom lub zwierzętom.
Polecam zapoznanie się z właściwościami i niebezpieczeństwami związanymi z wykorzystywaniem tych substancji – pomocna może być lektura ich kart charakterystyk MSDS.
Z przedstawionych wyżej powodów konieczne jest, aby przygotowania, same doświadczenia, a także porządki po nich prowadzić w sposób odpowiedzialny i uważny. Nie ma tu miejsca na improwizację. Konieczne są środki ochrony osobistej: fartuch, rękawiczki i okulary ochronne, a w czasie ogrzewania żrących substancji należy także ochronić twarz.

Doświadczenie I

Aby wykryć obecność enzymu w tkankach korzeni wspomnianych roślin (lub innych), wykorzystamy specyficzną substancję chemiczną – luminol C8H7N3O2. Jest to organiczny związek chemiczny, hydrazyd kwasu
3-aminoftalowego o wzorze strukturalnym przedstawionym na rys. 1.

 

Rys. 1. Wzór strukturalny luminolu



Luminol w warunkach normalnych ma postać drobnokrystalicznego proszku o barwie od żółtawej do jasnobrązowej (fot. 2).

 

Fot. 2. Luminol



Musimy przygotować odpowiedni roztwór poprzez rozpuszczenie w 50 cm3 wody destylowanej 1 g wodorotlenku sodu NaOH i niewielkiej ilości (rzędu miligramów) luminolu. Roztwór ten nie jest zbyt trwały, więc najlepiej sporządzać go na bieżąco. Do pow­­­­­stałego klarownego płynu dodajemy bezpośrednio przed wykonaniem próby 1,5 cm3 nadtlenku wodoru H2O2 o stężeniu 30% (perhydrolu) lub odpowiednio większą ilość aptecznej wody utlenionej 3%, uzyskując roztwór roboczy [1].
Korzeń chrzanu lub pietruszki po umyciu i osuszeniu należy utrzeć. Wystarczy niewielka ilość materiału (fot. 3).

Fot. 3. Utarty korzeń



Materiał roślinny trzeba przenieść do roztworu (fot. 4). Można zaobserwować wtedy powstawanie pewnych ilości tlenu z rozkładu nadtlenku w kontakcie z substancjami wchodzącymi w skład tkanek roślinnych.

 

Fot. 4. Materiał roślinny w roztworze


By móc poczynić najważniejszą obserwację, musimy zaciemnić pomieszczenie. Możemy wtedy zobaczyć, że roztwór w zetknięciu z utartym korzeniem zaczyna bardzo wyraźnie świecić. Wystarczy zamieszać płyn, by cała zawartość naczynia rozbłysnęła łatwym do zaobserwowania niebieskim światłem (fot. 5). Emisja jasnego światła może trwać od kilku do kilkunastu sekund, zaś słabszego nawet dłużej.

 

Fot. 5. Świecenie roztworu (ISO400, czas ekspozycji: 2 s.)


Istnieje też inny wariant opisanego doświadczenia: przeciętym korzeniem (lub wodnym wyciągiem z jego tkanek) możemy narysować jakiś wzór na papierze (fot. 6A). Po spryskaniu opisanym uprzednio roztworem roboczym możemy podziwiać na papierze świecące wzory (fot. 6B). Efekt doświadczenia zależy oczywiście od tego, jak dużo peroksydazy udało nam się nanieść na papier.

 

...

Pozostałe 70% treści dostępne jest tylko dla Prenumeratorów.

Co zyskasz, kupując prenumeratę?
  • 6 wydań czasopisma "Biologia w Szkole"
  • Dostęp do wszystkich archiwalnych artykułów w wersji online
  • ...i wiele więcej!
Sprawdź

Przypisy