Dołącz do czytelników
Brak wyników

Laboratorium

21 listopada 2018

NR 30 (Listopad 2018)

Fotosynteza w probówce

0 264

Fotosyntezę można zdefiniować jako proces umożliwiający wytworzenie związków organicznych z materii nieorganicznej. Zachodzi ona przy udziale światła w komórkach zawierających chlorofil lub bakteriochlorofil [1].
Wśród znanych nam procesów biochemicznych fotosynteza zajmuje jedno z najważniejszych miejsc i to nie tylko z akademickiego punktu widzenia. Zauważmy, że prawie cała energia, którą dysponują organizmy żywe, pochodzi – bezpośrednio lub pośrednio – ze Słońca i dociera do nas w dużej mierze jako promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu widzialnego. Fotosynteza pozwala więc organizmom autotroficznym na przekształcenie światła w postać energii wiązań chemicznych związków organicznych, która jest następnie wykorzystywana przez nie same, a także przez organizmy heterotroficzne. W ten sposób przy rozpatrywaniu Ziemi jako całości wzrasta masa materii organicznej. Dzieje się to oczywiście kosztem materii nieorganicznej. Wysoka koncentracja tlenu w atmosferze naszej planety jest skutkiem milionów lat prowadzenia fotosyntezy przez zróżnicowane organizmy.
Trzeba zaznaczyć, że istnieje także starszy ewolucyjnie mechanizm autotrofii, obywający się bez energii światła słonecznego. Jest to chemosynteza, w której energia zostaje wytworzona na drodze utleniania prostych związków nieorganicznych lub metanu [2]. Chemoautotrofami są pewne bakterie, np. nitryfikacyjne z rodzajów Nitrosomonas czy Nitrobacter, siarkowe Beggiatoa, żelazowe Leptospirillum, wodorowe Hydrogenobacter i inne [3]. Organizmy chemoautotroficzne pełnią ważną rolę w obiegu pierwiastków, takich jak azot i fosfor. Z punktu widzenia produkcji biomasy rola tego rodzaju przemian metabolicznych jest jednak mniejsza niż fotostyntezy.

Fot. 1. Liście szpinaku wykorzystane w doświadczeniu

W niniejszym artykule zajmiemy się głównie fotosyntezą u organizmów eukariotycznych, tj. takich, których komórki zawierają wyspecjalizowane organelle. U tych organizmów (np. roślin zielonych Chloroplastida) proces fotosyntezy zachodzi w odpowiednich strukturach – są to chloroplasty zawierające barwniki fotosyntetyczne, głównie chlorofile. U roślin chloroplasty występują najliczniej w komórkach liści, które są głównymi organami prowadzącymi asymilację dwutlenku węgla. Mniejszą ilość chloroplastów zawierają także inne niezdrewniałe tkanki.
Fotosynteza jest oczywiście bardzo skomplikowanym procesem, ale pewne jej mechanizmy możemy zbadać nawet niewielkim nakładem środków i czasu. Jednym z pomocnych temu środków jest tak zwana reakcja Hilla, biorąca swą nazwę od imienia Roberta Hilla, brytyjskiego biochemika, który w 1939 r. opisał wspomnianą reakcję [4]. Pozwala ona na przeprowadzenie fotosyntezy in vitro w izolowanych chloroplastach. 
Możemy wykonać dwie wariacje na temat reakcji Hilla. Pierwsza z nich jest bardziej efektowna, ale będzie wymagać nieco trudniejszych do zdobycia substancji. Druga natomiast da się przeprowadzić przy wykorzystaniu stosunkowo łatwo dostępnych związków chemicznych.

Izolacja chloroplastów

Aby przeprowadzić doświadczenie, musimy zaopatrzyć się w chloroplasty. W tym celu nadają się jakiekolwiek zielone, niezbyt twarde części roślin, a w szczególności liście. Odpowiednie są świeże liście szpinaku warzywnego Spinacia oleracea z rodziny szarłatowatych Amaranthaceae. Roślina ta jest ceniona jako bardzo bogate źródło witamin i białka, a także błonnika, karotenoidów oraz soli mineralnych. Ważną zaletą szpinaku są niewielkie koszty uprawy i – co szczególnie ważne także dla nas jako eksperymentatorów – jego dostępność przez cały rok, także w czasie niedoboru świeżych roślin jadalnych [5]. 
Do doświadczenia wystarczy niewielka ilość (kilka, kilkanaście) liści szpinaku (fot. 1). Inaczej niż w przypadku np. ekstrakcji chlorofili nie może być to szpinak mrożony, a jedynie świeży [6].
Dla osiągnięcia najlepszego efektu wszystkie czynności izolacyjne w stosunku do chloroplastów należy prowadzić w ciemności lub przy jak najsłabszym świetle. Także gotowy izolat powinien być przechowywany w warunkach braku oświetlenia. Ma to na celu ochronę chloroplastów przed uszkodzeniem.
Liście trzeba pociąć na niewielkie fragmenty, umieścić je w schłodzonym porcelanowym moździerzu i dodać nieco czystego piasku kwarcowego (ewentualnie drobnego i dokładnie oczyszczonego zwykłego piasku), co można zobaczyć na fot. 2.
Chloroplasty pozyskuje się w środowisku odpowiedniego roztworu izolacyjnego, którego rolą jest ochrona delikatnych organelli przed  uszkodzeniem. Do jego przygotowania potrzebujemy substancji z poniższej listy:

  • sacharoza C12H22O11
  • chlorek potasu KCl
  • roztwór buforowy (fosforanowy, pH 7)
Fot. 2. Fragmenty liści szpinaku z dodatkiem piasku w moździerzu

Nie wykorzystujemy tutaj żadnych silnie toksycznych substancji, ale należy zachować ostrożność – jak zawsze przy pracy z chemikaliami. Tyczy się to także każdej substancji wykorzystywanej w dalszych etapach doświadczeń opisywanych w tym artykule.
Do przygotowania wszystkich potrzebnych roztworów należy użyć wody destylowanej.
Bufor fosforanowy można uzyskać, odważając 5,026 g wodorofosforanu sodu Na2HPO4, 2,878 diwodorofosforanu sodu NaH2PO4 i rozpuszczając je w wodzie, tak by ostateczna objętość roztworu wyniosła 1 dm3 [7]. Oczywiście najlepiej jest skontrolować pH roztworu i ewentualnie skorygować ilości substancji wchodzących w jego skład albo dodać nieco zasady lub kwasu, tak by odczyn był jak najbliższy przytoczonej wartości.
Następnie, aby przygotować właściwy roztwór izolacyjny, musimy odważyć 136,92 g sacharozy i 0,75 g chlorku potasu, a następnie obie substancje rozpuścić w otrzymanym uprzednio buforze fosforanowym, tak aby końcowa objętość ponownie była równa 1 dm3. Roztwór można przechowywać przez pewien czas w szczelnie zamkniętym naczyniu w lodówce.
Przygotowane, uprzednio pofragmentowane liście szpinaku wraz z piaskiem należy zalać w moździerzu kilkunastoma centymetrami sześciennymi schłodzonego roztworu izolacyjnego, a następnie ucierać (fot. 3).

Fot. 3. Wszystko gotowe do ucierania

Piasek ułatwia zniszczenie komórek (w szczególności ich ścian komórkowych) i wydostanie się na zewnątrz chloroplastów. Ucierania nie należy prowadzić zbyt długo. Ciągle chłodną mieszaninę trzeba następnie przesączyć przez gazę, co powinno zatrzymać większe fragmenty komórek. Do przesączu przedostają się między innymi chloroplasty, które dzięki odpowiedniemu środowisku zapewnianemu przez roztwór izolacyjny nie ulegają ­natychmiastowemu uszkodzeniu.
Powstałą ciecz należy schłodzić np. w łaźni wodnej z dodatkiem lodu (fot. 4). Zielona zawiesina chloroplastów do czasu dalszych czynności powinna być przechowywana w warunkach braku oświetlenia w lodówce. 
W razie istnienia takiej możliwości zawiesinę chloroplastów można zagęścić poprzez wirowanie i zawieszenie uzyskanego osadu w nowym buforze izolacyjnym.
Zawiesiny chloroplastów nie można zbyt długo przechowywać, dlatego do następnych doświadczeń najlepiej przejść natychmiast albo krótko po izolacji.

Fot. 4. Zawiesina wyizolowanych chloroplastów

Sztuczna fotosynteza – wersja I

W tym doświadczeniu wykorzystamy 2,6-dichlorofenoloindofenol C12H7NCl2O2 (rys. 1).

Rys. 1. Wzór strukturalny 2,6-dichlorofenoloindofenolu

Związek jest używany jako kolorowy wskaźnik redoks. Jego forma utleniona ma barwę niebieską, zaś zredukowana jest bezbarwna. Substancja ta bywa także używana do określania koncentracji kwasu askorbinowego C6H8O6 (witaminy C)  w osoczu [8].
Aby przeprowadzić doświadczenie, należy do dwóch probówek lub innych naczyń wprowadzić po 5,8 cm3 zawiesiny chloroplastów i dodać do każdej z nich  0,2 cm3 0,1% roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu w takim samym buforze fosforanowym, jakiego użyliśmy do przygotowania roztworu izolacyjnego. W razie zbyt dużej koncentracji chloroplastów należy poeksperymentować z rozcieńczeniem zawiesiny. 
Obie próbki na tym etapie mają barwę ciemnoniebieską (fot. 5).

Fot. 5. Przygotowane próbki

Jedną z probówek wystawiamy następnie na światło. Najlepsze w tym celu jest światło słoneczne, ale w razie potrzeby można je zastąpić sztucznym. Ważne jest jednak, by w takim wypadku żarówka nie ogrzewała zbytnio układu reakcyjnego. Druga probówka powinna natomiast zostać dokładnie zabezpieczona przed światłem – np. przez owinięcie spożywczą folią aluminiową.
Obserwację próbki wystawionej na światło słoneczne warto prowadzić w czasie rzeczywistym. Efekt przedstawia fot. 6.

Fot. 6. Wpływ światła słonecznego na próbkę; A – 0 min (moment w ystawienia na światło słoneczne), B – 2 min, C – 4 min, D – 6 min, E – 8 min, F – 10 min

Jak widać, po ekspozycji na światło dosyć szybko doszło do całkowitego zaniku niebieskiej barwy 2,6-dichlorofenoloindofenolu, dzięki czemu ponownie można obserwować zielony kolor chlorofilu zawartego w chloroplastach.
Po zaniku barwy próbki naświetlanej należy ją porównać z drugą, pozostawioną w ciemności (fot. 7).

Fot. 7. Wynik doświadczenia; po lewej – próbka naświetlana, B – próbka przechowywana w ciemności

Możemy zaobserwować, że odbarwieniu uległa jedynie ta próbka, która była wystawiona na działanie promieni słonecznych. Uprawniony jest więc wniosek, że do zmiany barwy dochodzi tutaj w reakcji na światło.
Przedstawiona reakcja jest ciekawa, a jej efekt wyraźnie dostrzegalny. Zdaję sobie jednak sprawę, że wykorzystany w niej wskaźnik redoks może być trudny do zdobycia, dlatego poniżej przedstawiam uproszczoną wersję z wykorzystaniem bardziej dostępnych substancji.

Sztuczna fotosynteza – wersja II

W tym przypadku zamiast 2,6-dichlorofenoloindofenolu zastosujemy heksacyjanożelazian(III) potasu  K3[Fe(CN)6]. Jest to związek kompleksowy, więc wchodzący w jego skład anion składa się z żelaza(III) Fe3+ wraz z sześcioma grupami cyjankowymi CN-. Strukturę tego anionu przedstawia rys. 2.

Rys. 2. Anion heksacyjanożelazianowy(III)

Patrząc jedynie na wzory chemicz­ne, omawiany związek jest łatwo pomylić z heksacyjanożelazianem(II) potasu K4[Fe(CN)6]. Na szczęście obie substancje można rozróżnić gołym okiem, ponieważ o ile heksacyjanożelazian(II) ma barwę żółtą, to potrzebny nam heksacyjanożelazian(III) tworzy kryształy o pięknej czerwonej barwie (fot. 8).

Fot. 8. Kryształy heksacyjanożelazianu(III) potasu

Tutaj ostrzeżenie: sam heksacyjanożelazian(III) nie jest toksyczn...

Pozostałe 70% treści dostępne jest tylko dla Prenumeratorów.

Co zyskasz, kupując prenumeratę?
  • 6 wydań czasopisma "Biologia w Szkole"
  • Dostęp do wszystkich archiwalnych artykułów w wersji online
  • ...i wiele więcej!
Sprawdź

Przypisy