Dołącz do czytelników
Brak wyników

Biochemia

18 stycznia 2021

NR 42 (Styczeń 2021)

Przeciwciała kontra patogeny. O strukturze, roli i metodach produkcji przeciwciał słów kilka

114

W dobie pandemii choroby koronawirusowej COVID-19 wywołanej przez koronawirusa SARS-CoV-2 coraz więcej i coraz częściej słyszy się o przeciwciałach. Czym tak naprawdę są przeciwciała? Jak wygląda ich produkcja w organizmach pacjentów, a jak wygląda ich wytwarzanie w warunkach laboratoryjnych? W końcu dlaczego rola przeciwciał jest tak ważna podczas walki z patogenami?

Przeciwciała odgrywają zasadniczą rolę w obronie organizmu gospodarza przed patogenami dzięki możliwości rozpoznawania przez nie mikroorganizmów lub zakażonych komórek lub czynników pochodzących spoza organizmu, takich jak toksyny. Chociaż zapobieganie przedostawaniu się patogenów jest jednym z potencjalnych mechanizmów ochrony przed zakażeniem, przeciwciała stanowią podstawę wielu innych mechanizmów pozwalających zwalczać infekcje. Oprócz wiązania i bezpośredniej neutralizacji patogenów, przeciwciała wspomagają usuwanie bakterii, wirusów, grzybów i pasożytów poprzez ich interakcje z układem odpornościowym, wykorzystując szeroki wachlarz procesów zachodzących podczas walki z drobnoustrojami w ludzkim układzie odpornościowym. Przeciwciała mają zdolność tworzenia kompleksów immunologicznych, które kierują sekwestracją i wychwytem patogenów, usuwają toksyny, eliminują zakażone komórki, zwiększają prezentację antygenu dla układu odpornościowego i regulują stan zapalny. 
Już ponad 100 lat temu zaobserwowano, że podawanie surowicy (osocze krwi pozbawione fibrynogenu) zwierząt chorujących na tężec lub błonicę zapewniało ochronę nieuodpornionym zwierzętom. Obserwacje te dały początek stosowanej przez dziesięciolecia metodzie leczenia m.in. w przypadku błonicy, tężca, szkarlatyny i zapalenia opon  mózgowych. Warto wspomnieć, że choć terapia ta dała silne podwaliny do szeroko rozumianego wykorzystania przeciwciał, to obecnie w dużej mierze została wyparta przez szczepionki i antybiotyki. Przeciwciała są jednym z najważniejszych elementów humoralnej odpowiedzi immunologicznej.
Przeciwciała są białkami zbudowanymi z dwóch par łańcuchów polipeptydowych: łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. Łańcuchy lekki i ciężki są połączone ze sobą mostkami disiarczkowymi. Razem tworzą charakterystyczną strukturę podobną do litery γ, gdzie końce ramion litery γ są miejscami rozpoznającymi antygen. Produkcja przeciwciał możliwa jest dzięki aktywności limfocytów B, które stanowią element nabytego systemu odporności. Łańcuchy lekki i ciężki możemy podzielić na fragmenty stałe C i fragmenty zmienne V. Fragmenty zmienne są odpowiedzialne za specyficzne wiązanie się z antygenem natomiast fragmenty stałe są odpowiedzialne strukturę przeciwciała oraz za modulowanie odpowiedzi układu odpornościowego po związaniu antygenu (aglutynacja, opsonizacja lub aktywacja systemu dopełniacza) i zależą od typu przeciwciała. Powinowactwo do antygenu zapewnione jest przez trzy pętle we fragmencie zmiennym łańcuchów lekkiego i ciężkiego. Pętle te zwane są regionem zapewniającym komplementarność. W odniesieniu do przeciwciał wyróżnia się również fragmenty Fab oraz Fc. Fragmenty te powstają poprzez proteolityczne cięcie przeciwciała. Fragment Fab jest fragmentem ramienia przeciwciała i rozpoznaje antygen. Fragment Fc stanowi trzon przeciwciała i odpowiedzialny jest za wiązanie się z receptorami na powierzchni komórek układu odpornościowego. Fragmenty Fab są mniejsze i łatwiejsze w produkcji i ponieważ nie oddziałują z komórkami, są chętnie wykorzystywane jako leki. 
Przeciwciała ze względu na ich budowę możemy podzielić również na klasy i podklasy. U ssaków istnieje pięć klas przeciwciał, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, z których każda ma swoją własną klasę łańcuchów ciężkich – odpowiednio α, δ, ε, γ i μ. Cząsteczki IgA mają łańcuchy α, cząsteczki IgG mają łańcuchy γ i tak dalej. Ponadto istnieje wiele podklas immunoglobulin IgG i IgA; na przykład istnieją cztery ludzkie podklasy IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), które mają odpowiednio łańcuchy ciężkie γ1, γ2, γ3 i γ4. Różne łańcuchy ciężkie nadają charakterystyczną konformację regionom zawiasowym i ogonowym przeciwciał, co powoduje, że każda klasa (i podklasa) ma swoje własne, charakterystyczne właściwości.
Przeciwciała powstają w procesie dojrzewania. Uważa się, że ludzki organizm jest w stanie wytworzyć ~1011 różnych przeciwciał. Jednak liczba ta jest większa niż liczba genów kodujących wszystkie białka, których jest około 30 tys. Jak więc jest to możliwe? 
Limfocyty B na początku produkują niedojrzałe przeciwciała. Takie komórki nazywamy naiwnymi. Co więcej, te przeciwciała nie są wytwarzane do krwi, lecz na początku znajdują się na powierzchni komórki, tworząc receptor limfocytu B. Gdy przeciwciało rozpozna antygen, naiwny limfocyt B staje się limfocytem aktywowanym. Aktywacja limfocytów następuje głównie w śledzionie, migdałkach, węzłach chłonnych, czyli tam gdzie antygeny są rozpoznawane. Aktywowane limfocyty B rozpoczynają proces zwany dojrzewaniem, w którym zachodzi rekombinacja pomiędzy fragmentami genomu ko­­dującymi fragmenty przeciwciał. Istnieje kilkanaście różnych genów kodujących fragmenty łańcuchów lekkich i ciężkich. W procesie dojrzewania następuje łączenie tych fragmentów w sposób losowy. Pozwala to na otrzymywanie dużej liczby różnych przeciwciał z ma­­­­­­łej liczby genów. W ostatnim etapie na­­­­­­stępuje proces dojrzewania powi­nowactwa. W procesie tym następują indukowane mutacje fragmentów genomu kodujących fragment CDR. W ten sposób wytwarzany jest repertuar ogromnej liczby przeciwciał. Dojrzałe przeciwciała stają się komórkami pamięci, które po kolejnej ekspozycji na antygen namnażają się i stają się komórkami plazmatycznymi, które krążą we krwi i wytwarzają przeciwciała.
Przeciwciała można wytwarzać poprzez immunizację zwierząt, np. królików, myszy, szczurów, ale również kóz. Do krwi zwierzęcia wprowadza się antygen, dla którego chcemy otrzymać przeciwciała wraz z adiuwantem pobudzającym układ odpornościowy do wytwarzania przeciwciał. Zwierzęta w naturalny sposób wytwarzają przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi. Następnie z surowicy krwi oczyszcza się w sposób selektywny pulę przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi. Tak otrzymane przeciwciała składają się z wielu różnych przeciwciał rozpoznających różne fragmenty antygenu, tzw. epitopy. Takie przeciwciała nazywamy poliklonalnymi (pAbs – ang. polyclonal antibodies). Nazwa ta nawiązuje do faktu, że przeciwciała te produkowane są przez różne klony komórek plazmatycznych. Niekiedy może się zdarzyć, np. w chorobach nowotworowych związanych z komórkami limfocytów B, że tylko jeden klon limfocytów B dzieli się szybciej niż inne i zaczyna produkować jeden rodzaj przeciwciał. Takie przeciwciało rozpoznające jeden określony epitop nazywamy przeciwciałem monoklonalnym (mAbs – ang. monoclonal antibodies). Zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne mają szerokie zastosowanie w medycynie i nauce. 
 

POLECAMY

Rys. 1. Struktura i schemat budowy przeciwciał. A. Struktura przestrzenna przeciwciała otrzymana za pomocą badań krystalograficznych. Kolorem niebieskim i zielonym zaznaczone są dwie połówki przeciwciała. Odcieniem jaśniejszym zaznaczone są łańcuchy ciężkie, a ciemniejszym łańcuchy lekkie. Miejsce wiązania antygenu zaznaczone jest kolorem żółtym. B. Oddziaływanie przeciwciała z antygenem. Struktura przestrzenna fragmentu Fab przeciwciała (fragmenty zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego zaznaczono za pomocą koloru czerwonego) wiążącego lizozym białka jaja kurzego (zaznaczony kolorem pomarańczowym). Łańcuch główny białek jest zaprezentowany w postaci wstążek nałożonych na model atomowy koloru szarego. Miejsce pętli CDR zaznaczono kolorem żółtym. C. Schemat przedstawiający budowę przeciwciała wraz z opisanymi elementami struktury. Rysunki autorki. 


Początkowo produkcja przeciwciał oparta była na immunizacji zwierząt laboratoryjnych. Główna trudność w produkcji i stosowaniu przeciwciał otrzymywanych tą metodą związana jest z tym, że przeciwciała pochodzenia zwierzęcego po jakimś czasie mogą zostać rozpoznane przez ludzki układ odpornościowy, tak jak każda inna obca cząsteczka. Nie będą one wówczas aktywne i zmniejszy się ich potencjał terapeutyczny. Koniecznością zatem stało się opracowanie strategii mającej za zadanie przezwyciężyć tę trudność. Wykorzystano fakt modułowej budowy przeciwciał, a konkretnie fakt, że miejsce wiązania antygenu znajduje się we fragmencie zmiennym łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. W tym celu stworzono przeciwciała chimeryczne składające się z fragmentów stałych łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego pochodzących z ludzkiego przeciwciała oraz fragmentów zmiennych pochodzących z mysiego przeciwciała rozpoznającego dany antygen. W kolejnym kroku zastąpiono kolejne części fragmentów zmiennych fragmentami pochodzącymi z ludzkiego przeciwciała. Obecnie humanizowane przeciwciała zawierają jedynie fragmenty CDR (region determinujący komplementarność) oryginalnego przeciwciała pochodzącego od zwierząt. W ten sposób takie przeciwciało jest praktycznie identyczne z przeciwciałami produkowanymi przez ludzki organizm. 
Krokiem milowym w badaniach nad przeciwciałami było opracowanie sposobu ich produkcji na dużą skalę. W procesie immunizacji zwierząt powstaje wiele przeciwciał mogących rozpoznawać antygen. Ponadto proces ten jest długotrwały i kosztochłonny. W celu przezwyciężenia tych trudności zaczęto wykorzystywać specjalne linie komórkowe zwane hybrydomą. Za to osiągnięcie Cezar Milstein i Georges Kohler zostali uhonorowani Nagrodą Nobla w dziedzinie medycyny w 1984 r. Hybrydoma jest linią komórkową powstałą poprzez fuzję komórek nowotworu szpiczaka mnogiego (jest to linia komórkowa nieśmiertelna, mogąca dzielić się i mnożyć w nieograniczony sposób) z komórkami produkującymi przeciwciała pochodzącymi z organizmu poddanego immunizacji, które nie mogą się dzielić. W ten sposób można wyselekcjonować pojedynczą linię komórkową, która produkuje przeciwciała o największym powinowactwie do antygenu i potencjale terapeutycznym w sposób ciągły i powtarzalny. 
Wraz z rozwojem wiedzy na temat immunologii oraz genetyki i biologii molekularnej możliwe stało się uzyskanie sekwencji kodujących łańcuch lekki i ciężki danego monoklonalnego przeciwciała, a w konsekwencji pojawiła się możliwość wprowadzenia ich za pomocą metod inżynierii genetycznej do linii komórkowych, a także różnych organizmów, co pozwoliło na ich wielkoskalową produkcję. Stworzone w ten sposób linie komórkowe, produkujące przeciwciała, stanowią obecnie najczęściej wykorzystywaną platformę do komercyjnej produkcji tych białek. Do najpopularniejszych linii komórkowych wykorzystywanych w tym procesie należą komórki HeLa, HEK293 oraz komórki jajnika chomika CHO. Wykorzystanie linii komórkowych istotnie uprościło i ustandaryzowało proces produkcji przeciwciał, ale nie można nie wspomnieć, że nie jest to system pozbawiony wad. Linie komórkowe, szczególnie ludzkie, są podatne na zakażenia wirusowe, które mogą być szkodliwe dla ludzi. W związku z tym, podczas produkcji, muszą być zachowane szczególne środki ostrożności, które mają na celu zachowanie pełnej sterylności. 
W ostatnich kilkunastu latach wynaleziono sposób na produkcję rekombinowanych białek, w tym również przeciwciał w roślinach. Metodami inżynierii genetycznej do genomu rośliny (np. tytoniu) wprowadza się fragmenty kodujące białko – przeciwciało. Rośliny wytwarzają następnie te przeciwciała, które można wyizolować i oczyścić np. z liści. Inną metodą jest użycie tak zwanej przejściowej ekspresji przeciwciał w roślinach za pomocą bakterii Agrobacterium tumefaciens. Rośliny zanurza się w zawiesinie bakterii i poddaje działaniu niskiego ciśnienia. Roztwór bakterii wnika w przestrzenie międzykomórkowe. Bakterie A.tumefaciens mają zdolności do wprowadzania sekwencji DNA do komórki roślinnej i ekspresji wybranych genów bakteryjnych z tego fragmentu, również sztucznie wprowadzonych sekwencji kodujących przeciwciała. W ten sposób można produkować przeciwciała szybko i w razie potrzeby bez żmudnego procesu tworzenia organizmów GMO. Ta technika była wykorzystywana do produkcji przeciwciał stosowanych w zwalczaniu epidemii wirusa Ebola w 2014 r. Zamiast bakterii można użyć również zmodyfikowanych wirusów roślinnych, t...

Pozostałe 70% treści dostępne jest tylko dla Prenumeratorów

Co zyskasz, kupując prenumeratę?
  • 6 wydań czasopisma "Biologia w Szkole"
  • Dostęp do wszystkich archiwalnych artykułów w wersji online
  • ...i wiele więcej!
Sprawdź

Przypisy