Barwniki roślinne - zadania eksperymentalne

Doświadczenie nr 1. Badanie wpływu odczynu roztworu na barwę antocyjanów

Odczynniki: 

• surowiec:
• 5 g kwiatów hibiskusa    
• 10 g czerwonych owoców
• 5 g kwiatów malwy czarnej lub torebka herbatki owocowej
• woda, metanol lub woda-metanol
• 0,1 mol/dm3 HCl
• 0,1 mol/dm3 NaOH lub KOH

Aparatura i szkło:

• zlewki 200 ml
• pipety Paustera lub biureta 50 ml
• lejek zwykły (średnica około 10 cm)
• papierki wskaźnikowe (1–14 pH)
• 2 statywy do probówek
• 20 probówek
• bagietka szklana

Na początku należy przeprowadzić macerację wybranego surowca roślinnego (10 g rozdrobnionych czerwonych owoców, 5 g kwiatów hibiskusa, 5 g kwiatów malwy czarnej lub torebka herbatki owocowej). Wykonuje się ją poprzez umieszczenie każdego z surowców (lub wybranych) w osobnej zlewce o pojemności 200 ml i zalanie 50 ml metanolu lub mieszaniny woda-metanol (1:1) lub wody (najlepsze efekty uzyskuje się stosujac metanol lub mieszaninę 1:1 metanol woda) na około pół godziny (im dłużej tym intensywniejsza będzie barwa otrzymanego maceratu). Co kilka minut należy pomieszać bagietką. Uzyskany macerat należy przesączyć przez zwykły lejek (może też być małe sitko). Zbadać pH wyjściowego roztworu za pomocą papierka uniwersalnego. Następnie do 7 probówek wlać po około 2 ml roztworu wyjściowego antocyjanów i rozcieńczyć 1 ml wody destylowanej. Do każdej kolejnej probówki dodawać coraz większą porcję wodnego roztworu wodorotlenku sodu lub potasu zbadać i zanotować zmianę barwy oraz wartość pH odczytaną na podstawie testu wykonanego uniwersalnym papierkiem wskaźnikowym (fot. 1A). Uszykować drugi zestaw probówek w sposób podany powyżej, ale tym razem należy dodawać coraz to większe porcje roztworu kwasu solnego 0,1 mol/dm3 (fot. 1B).

Poniższe fotografie przedstawiają zmiany zabarwienie następujące w probówkach po dodaniu roztworu wodorotlenku (fot. 1A) oraz po dodawaniu roztworu kwasu (fot. 1B). 

Doświadczenie nr 2. Wpływ obecności różnych jonów metali i anionów na barwę roztworu antocyjanów/flawonoidów 

Odczynniki: 

• surowiec:
• 5 g kwiatów hibiskusa
• 10 g czerwonych owoców
• 5 g kwiatów malwy czarnej
• 2 g łuski cebuli
• metanol, woda + metanol, woda
• sole nieorganiczne (tabela poniżej)    

Aparatura i szkło:

• bagietka
• zlewki 200 mll
• lejek zwykły (średnica około 10 cm)
• probówki – 30 sztuk
• papierki wskaźnikowe (1–14 pH)
• ipety Paustera, wkraplacz
• statyw do probówek 

Należy przeprowadzić macerację wybranego surowca roślinnego w sposób opisany powyżej poprzez dodanie do surowca roślinnego możliwie małej ilości rozpuszczalnika, ale takiej, aby znalazł się on pod powierzchnią cieczy. Następnie intensywnie mieszać od 10–30 minut bagietką, po czym należy przesączyć na lejku zwykłym (lub małym sitku). Rozcieńczyć wodą do 20 ml.

Sporządzić wodne roztwory soli nieorganicznych poprzez całkowite rozpuszczenie około 50 mg (szczypta) związku w najmniejszej możliwej ilości wody (około 3 ml) w oznaczonych probówkach (wg tabeli podanej poniżej). Można też przetestować wpływ kationu/anionu soli (mając na uwadze odczyn ich wodnego roztworu dla np.: Li2CO3, Na2CO3, NaNO2, Na2SO3, KBr, K2CO3, CaCl2, ZnCl2. Przygotować roztwór, który będzie wzorcem koloru poprzez dodanie 6–10 kropli wodnego roztworu antocyjanów do probówki z wodą destylowaną. Dodawać do poszczególnych probówek z wodnymi roztworami soli za pomocą pipety Paustera kroplami roztwór antocyjanów, mieszać, obserwując zmianę barwy i zanotować ją w tabeli. Określić, jaki odczyn miały wyjściowe roztwory soli. Po upływie około pół godziny sprawdzić, czy barwy roztworów uległy zmianie i obserwacje zanotować w tabeli. Na podstawie wiadomości o antocyjanach i wodnych roztworach soli stosowanych w ćwiczeniu sformułować zależności pomiędzy barwą roztworu a składnikami znajdującymi się w danej probówce. 

W roztworze o odczynie kwasowym powinno być czerwone zabarwienie, obojętnym bezbarwne, a zasadowym niebieskie.

Wpływ roztworów wybranych soli ilustruje fot 2. CaCl2 i MgSO4 nie powoduje widocznych zmian barwy, ale dodanie wodnego roztworu azotanu(V) glinu, pomimo kwasowego odczynu roztworu tej soli, wywołuje powstanie fioletowego zabarwienia z powodu kompleksowania jonów glinu. Analogiczna reakcja zachodzi po dodaniu CuCl2, gdy powstaje barwa błękitna oraz soli żelaza(II) i (III), gdy obserwuje się, odpowiednio, żółto-brązowe i żółte zabarwienie roztworów.

Po upływie około pół godziny barwy poszczególnych roztworów powinny ulec wzmocnieniu. W eksperymencie można zastosować też inne sole, gdyż jego celem jest uwidocznienie, jak jony poszczególnych metali (zwłaszcza dwuwartościowych i trójwartościowych wpływają na zmianę zabarwienia roztworu antocyjanów).

Na obserwowaną barwę ma też wpływ fakt, czy surowiec roślinny był macerowany wodą, metanolem, czy mieszaniną woda-metanol. Barwa jest też zależna od zastosowanego surowca roślinnego, np. ekstrakt z kwiatów malwy czarnej będzie miał ciemnofioletowe zabarwienie, gdyż w swoim składzie zawiera najwięcej antocyjanu malwidyny. W przypadku flawonoidów z łusek cebuli będzie można zaobserwować różne odcienie barwy żółtej i brązowej lub roztwory praktycznie bezbarwne. Do maceracji można zastosować też etanol zamiast metanolu, gdyż oba alkohole dobrze wymywają barwne składniki z surowca roślinnego.

Tab. 1. Badanie wpływu pH roztworu oraz jonów metali na zabarwienie roztworu antocyjanów

Sól	Odczyn roztworu wynikający z zapisu  reakcji hydrolizy soli jonowo	Barwa obserwowana  w momencie dodania	Barwa  po 10 minutach
MgSO4	kwasowy
CaCl2	obojętny
Al(NO3)3	kwasowy
CuCl2	kwasowy
FeSO4	kwasowy
FeCl3	kwasowy
Na2SO3	zasadowy

 

Doświadczenie nr 3. Owocowe antocyjany – izolacja oraz identyfikacja antocyjanów zawartych w czerwonych owocach 

Odczynniki: 

• surowiec roślinny po 10 g owoców:
• czerwone jabłka (skórka),
• porzeczka/jagoda 
• żurawina
• truskawki (owoce mogą być mrożone)    
• woda destylowana 
• metanol 
• HCl stęż. 
• kwas mrówkowy

Aparatura i szkło:

• zlewki poj. 100 ml 
• płytki TLC (celuloza) 
• probówki 
• bagietka

Część A. Maceracja owoców. Proces ten przeprowadza się w celu wyizolowania z surowca roślinnego antocyjanin (tabela 2) z zastosowaniem mieszaniny metanol:HCl (99:1, v/v) w czasie 0,5–1 godziny, mieszając bagietką. Następnie przesączyć i zatężyć przesącz pod zmniejszonym ciśnieniem do możliwie niewielkiej objętości. Na tym etapie pobiera się niewielką ilość otrzymanych antocyjanin w celu wykonania analizy TLC, a na pozostałych porcjach przeprowadza się hydrolizę opisaną w części B.

Analiza TLC antocyjanin. Trzeba wykonać analizę TLC antocyjanin wyizolowanych z poszczególnych owoców. W tym celu należy uszykować mieszaninę rozpuszczalników stanowiących fazę ruchomą – stężony HCl:kwas mrówkowy:woda (19:39,6:41,4; v/v). Przygotować płytki plastikowe o wymiarach 7,5 x 4 cm pokryte celulozą (płytka będzie się rozwijała ok. 20 min). Przykład wyglądu uzyskanej płytki przedstawiono na rysunku (rys. 1), a wartości Rf zestawiono w tabeli 3.
Na płytce poszczególne antocyjaniny zabarwiają się na inny kolor. Pelargonidyna pojawia się postaci różowej, pomarańczowo-czerwonej lub szkarłatnej plamki, natomiast cyjanidyna w kolorze karmazynowym lub purpurowym, a delfinidyna niebieska lub...