Dołącz do czytelników
Brak wyników

Temat numeru

13 września 2018

NR 12 (Listopad 2015)

BARKODING DNA – molekularne metkowanie organizmów żywych

0 297

Taksonomia to niewątpliwie podstawowa i jedna z najstarszych dziedzin biologii utożsamiana często z systematyką. Taksonomia zajmuje się klasyfikowaniem organizmów oraz techniką wyróżniania i opisywania gatun­ków, m.in. wskazaniem cech diagnostycznych, na podstawie których można ustalić przynależność gatunkową ­poszczególnych okazów roślin, zwierząt czy grzybów. Prawidłowe oznaczenie gatunku jest kluczową sprawą w wielu badaniach, jest konieczne, aby odróżnić na przykład rośliny lecznicze od trujących, rozpoznać organizmy chorobotwórcze czy odróżnić gatunki pospolite od bardzo rzadkich i cennych dla danego regionu w celu ich ochrony. Jednak pewne grupy organizmów, jak bakterie, pierwotniaki, glony, grzyby mikroskopijne, niektóre pajęczaki, np. roztocza, czy mszaki są trudne do rozpoznania na podstawie cech morfologicznych. 

Z tym zadaniem radzą sobie tylko najlepsi specjaliści zajmujący się szczegółowo daną grupą organizmów i mający duże doświadczenie. W tych trudnych obszarach badań taksonomicznych pomocne okazu­ją się techniki molekularne. Ogromny postęp technologiczny w dziedzinie biologii molekularnej i bioinformatyki oraz związane z tym uproszczenie niektórych procedur sprawiły, że stały się one łatwiejsze, tańsze i bardziej dostępne w innych dziedzinach biologii. Dzięki temu zrodził się pomysł powszechnego wykorzystania różnic w sekwencji DNA w taksonomii do identyfikacji gatunków, w analogiczny sposób jak znako­wane są produkty w hipermarketach za pomo­cą kodu paskowego, czyli zrodziła się idea barkodingu DNA – stworzenia kodów paskowych DNA dla organizmów żywych. Jak widać na rycinie 1, sekwencje zestawione jedna pod drugą i dopasowane sprawiają, że poszczególne nukleotydy: A (adenina), C (cytozyna), G (guanina) i T (tymina), tworzą paski podobnie jak w kodzie paskowym. W programach komputerowych dla wygody poszczególne nukleotydy zaznaczone są różnymi kolorami: A – zielony, C – niebieski, G – fioletowy, T – czerwony, dobór kolorów zależy od programu. W styczniu 2016 r. minie 13 lat od opublikowania pierwszej pracy poświęconej idei barkodingu DNA. Jej pomysłodawcą i twórcą był profesor Paul Hebert, a jednym z założeń było stworzenie techniki standardowej w skali świata. W celu koordynowania postępu prac rozwijających metodę barkodingu DNA w maju 2004 r. powstało Consortium for the Barcode of Life (CBOL) zrzeszające liczne ośrodki naukowe z całego świata. Obecnie konsorcjum liczy ponad 2 tys. członków. 


Ryc. 1. Fragment sekwencji genu matK dla różnych gatunków oznaczonych symbolami A-E przyrównanych w programie MEGA 6.0

W taksonomii w dalszym ciągu obo­wiązuje binominalna nomenklatura stworzona przez Karola Linneusza – twórcę nowoczesnej taksonomii – oraz wypracowane w ciągu wieków reguły klasycznego opisu gatunków. Trzeba jednak podkreślić, że są to często badania bardzo czasochłonne, a w niektórych przypadkach mające także swoje ograniczenia. Dodatkowo ogromne tempo wymierania gatunków i często brak specjalistów znających dobrze poszczególne grupy organizmów spowalnia ich opisywanie i możemy po prostu nie zdążyć z ich katalogowaniem. Obecnie opisanych jest zaledwie ok. 1,7 mln gatunków z szacowanego na ok. 10 mln bogactwa gatunkowego na Ziemi. W procesie opisu nowych gatunków nie da się zastąpić pracy klasycznych taksonomów, ale biologia molekularna może przyśpieszyć i ułatwić identyfikację gatunków, tworząc katalogi genetycznych kodów paskowych, czyli barkodów DNA. Metoda barkodingu DNA opiera się na różnicach w sekwencji nukleotydów pomiędzy różnymi gatunkami. Celem barkodingu było znalezienie odpowiedniego regio­nu DNA, najlepiej jednego, którego sekwencja pozwoliłyby na odróżnienie większości gatunków żyjących na świecie. Kolejnym celem było uzyskanie sekwencji z różnych grup organizmów w celu utworzenia referencyjnej bazy danych. Zdaniem profesora Zbigniewa Mirka, uznanego botanika i systematyka roślin, barkoding DNA jest cenną inicja­tywą, która może ułatwić i znacznie przyśpieszyć badania taksonomiczne. Profesor Mirek jednocześnie podkreśla, że metoda ta nie może zastąpić klasycznych metod stosowanych dotychczas w taksonomii i systematyce, szczególnie w przypadku opisywania nowych dla wiedzy gatunków. Profesor zwraca również uwagę na konieczność współpracy biologów molekularnych stosujących barkoding DNA ze specjalistami zajmującymi się taksonomią różnych grup w celu poprawnej identyfikacji materiałów użytych do badań, co jest kluczowym etapem analizy barkodów.

Gdzie barkoding DNA znajdzie zastosowanie? 

Technika ta jest już coraz szerzej stosowana, m.in. w taksonomii, gdzie pomaga oznaczyć do gatunku takie okazy, które w tradycyjny sposób są bardzo trudne, a czasem nawet niemożliwe do oznaczenia, może również ułatwić odkrycie i opisanie nowych gatunków. Metoda ta znajduje zastosowanie także w badaniach ekologicznych, np. pomaga stwierdzić, jakie gatunki wchodzą w skład pokarmu określonych zwierząt, w badaniach fitogeograficznych do analizy dróg migracji gatunków. Barkody DNA umożliwiają ponadto kontrolę jako­ści i pochodzenia sprzedawanej żywności, np. herbat czy ziół, i wykrywanie fałszerstw na tym polu, jak również kontrolę handlu chronionymi gatunkami roślin i zwierząt. Dużą zaletą tej metody jest możliwość identyfikacji organizmu na podstawie fragmentu tkanki, nasion, gdyż sekwencję DNA można uzyskać z niewielkiej ilości materiału biologicznego. Daje też szansę identyfikacji organizmu na podstawie form rozwojowych (jaj, larw) czy grzybni niemożliwych do oznaczenia innymi metodami (Mirek 2007; Freeland 2008; Grzywacz i Bogdanowicz 2009). Wykorzystanie sekwencji DNA w badaniach taksonomicznych i filogenetycznych nie jest ­nowym pomys­łem. Markery molekularne, a jeszcze wcześniej białkowe (allozymy), były z powodzeniem stosowane w taksonomii od dawna. Jednak barkoding DNA wprowadził standaryzację metody poprzez wyznaczenie specjalnego regionu DNA do tego celu oraz ustalenie kryteriów, jakie muszą spełniać wskazane jako barkod sekwencje.

Metoda barkodingu DNA opiera się na różnicach w sekwencji nukleotydów pomiędzy różnymi gatunkami. Celem barkodingu było znalezienie odpowiedniego regionu DNA, najlepiej jednego, którego sekwencja pozwoliłaby na odróżnienie większości gatunków żyjących na świecie.

Pierwszym etapem badań było wskazanie odpowiedniej sekwencji

Idealną sytuacją byłoby znalezienie jednej sekwencji, która umożliwiłaby identyfikację każdego gatunku występującego na Ziemi. Szybko jednak okazało się, że to nie będzie niemożliwe. Z wykorzystaniem sekwencji DNA w metodzie barkodingu wiążą się pewne ograniczenia, bowiem nie każdy fragment sekwencji może być barkodem. 

Tylko nieliczne obszary genomu nadają się do wykorzystania jako barkody. Muszą się one charakteryzować następującymi cechami: 

  1. Niską zmiennością (poniżej 2%) w obrębie jednego gatunku, a wysoką pomiędzy różnymi gatunkami. 
  2. Możliwością zaprojektowania uni­­wersalnych, czyli jednakowych dla wszystkich grup organizmów starterów do powielania docelowych sekwencji.
  3. Odpowiednią długością sekwen­cji ok. 600–700 pz – jest to dłu­gość możliwa do odczytania w jednej reakcji sekwencjono­wania.
  4. Nie powinny zawierać zbyt dużej liczby insercji lub delecji, które utrudniają porównanie sek­wencji.
  5. Pożądaną cechą jest występowanie w genomie w dużej liczbie kopii, co jest ważne w przypadku zdegradowanego materiału kopalnego lub zielnikowego
  6. Sekwencja musi występować u wszystkich organizmów. Dla­te­go dobrym źródłem odpowied­nich sekwencji są genomy mito­chondrialne i chloroplastowe, któ­re w komórce występują w dużej liczbie kopii, w przeciwieństwie do genomu jądrowego występującego u organizmów diploidalnych tylko w dwóch kopiach.

Królestwo zwierząt

Dla świata zwierząt sekwencję spełniającą powyższe kryteria udało się szybko ustalić. Paul Hebert w 2003 r. ­zaproponował mitochondrialną sekwen­cję kodującą podjednostkę I genu oksydazy cytochromowej (cox1 lub CO1), która łączy wysoką uniwersalność i pożą­daną zmienność. Fragment tego genu o długości 648 pz wyznaczony jako barkod wykazuje wystarczająco dużą zmienność pomiędzy gatunkami, która umożliwia jednoznaczną identyfikację gatunków w ponad 95% przypadków w większości głównych grup zwierząt. Na podstawie analizy 2238 gatunków zwierząt (13 320 porównanych par gatun­ków) należących do 11 typów Paul ­Hebert wraz z zespołem stwierdził, że 98% par gatunków wykazuje więcej niż 2% różnic w sekwencji, a 75% par wyka­zuje zróżnicowanie powyżej 8%. Wyjątek stanowią parzydełkowce (Cnidaria), gdzie 94% badanych par gatunków różni się mniej niż o 2%. Średnie zróżnicowanie sekwencji 11,3% wskazuje, że większość par gatunków dzieli więcej niż 50 mutacji (substytucji) na każde 500 pz porównywanego odcinka genu cox1. Ważnym zadaniem było ustalenie tzw. wartości progowej, czyli liczby różnic (mutacji) wyrażonej w procentach, którą można uznać za wystarczającą do odróżnienia dwóch gatunków. Paul ­Hebert z zespołem w 2004 r. zaproponowali, że wartość progowa, czyli zróżnicowanie pomiędzy gatunkami, powinna być 10 razy większa niż średnia wartość zmienności wewnątrzgatunkowej dla badanej grupy. Badania prowadzone w ciągu ostatnich 10 lat potwierdziły bardzo dużą skuteczność sekwencji cox1 do rozróżniania gatunków w różnych grupach zwierząt, takich jak ptaki, ryby, owady. Na przykład wśród 260 gatunków ptaków z Północnej Ameryki różnice pomiędzy blisko spokrewnionymi gatunkami były średnio 18 razy większe niż wewnątrz gatunków. Do 2011 r. zbarkodowano 23 000 okazów z reprezentujących 3800 gatunków, czyli więcej niż 1/3 liczby ptaków na świecie. Barkody DNA wykonano także dla naczelnych, potwierdzają one jedność gatunku Homo sapiens. Porównanie sekwencji barkodu cox1 pokazuje, że różnimy się między sobą pod względem 1 lub 2 pz na 648 (0,15–0,30%), od szympansów o ok. 60 pz (9,26%), a od goryli o ok. 70 pz 
(10,8%). 

Królestwo roślin

Dla świata zwierząt sekwencję spełniającą powyższe kryteria udało się szybko ustalić. Paul Hebert w 2003 r. ­zaproponował mitochondrialną sekwen­cję kodującą podjednostkę I genu oksydazy cytochromowej (cox1 lub CO1), która łączy wysoką uniwersalność i pożą­daną zmienność. Fragment tego genu o długości 648 pz wyznaczony jako barkod wykazuje wystarczająco dużą zmienność pomiędzy gatunkami, która umożliwia jednoznaczną identyfikację gatunków w ponad 95% przypadków w większości głównych grup zwierząt. Na podstawie analizy 2238 gatunków zwierząt (13 320 porównanych par gatun­ków) należących do 11 typów Paul ­Hebert wraz z zespołem stwierdził, że 98% par gatunków wykazuje więcej niż 2% różnic w sekwencji, a 75% par wyka­zuje zróżnicowanie powyżej 8%. Wyjątek stanowią parzydełkowce (Cnidaria), gdzie 94% badanych par gatunków różni się mniej niż o 2%. Średnie zróżnicowanie sekwencji 11,3% wskazuje, że większość par gatunków dzieli więcej niż 50 mutacji (substytucji) na każde 500 pz porównywanego odcinka genu cox1. Ważnym zadaniem było ustalenie tzw. wartości progowej, czyli liczby różnic (mutacji) wyrażonej w procentach, którą można uznać za wystarczającą do odróżnienia dwóch gatunków. Paul ­Hebert z zespołem w 2004 r. zaproponowali, że wartość progowa, czyli zróżnicowanie pomiędzy gatunkami, powinna być 10 razy większa niż średnia wartość zmienności wewnątrzgatunkowej dla badanej grupy. Badania prowadzone w ciągu ostatnich 10 lat potwierdziły bardzo dużą skuteczność sekwencji cox1 do rozróżniania gatunków w różnych grupach zwierząt, takich jak ptaki, ryby, owady. Na przykład wśród 260 gatunków ptaków z Północnej Ameryki różnice pomiędzy blisko spokrewnionymi gatunkami były średnio 18 razy większe niż wewnątrz gatunków. Do 2011 r. zbarkodowano 23 000 okazów z reprezentujących 3800 gatunków, czyli więcej niż 1/3 liczby ptaków na świecie. Barkody DNA wykonano także dla naczelnych, potwierdzają one jedność gatunku Homo sapiens. Porównanie sekwencji barkodu cox1 pokazuje, że różnimy się między 


Ryc. 2. Sposób składania sekwencji uzyskanych z obu nici DNA (F i R) w sekwencję konsensusową w specjalnym programie komputerowym, na rysunku przedstawiono fragment sekwencji genu matK

sobą pod względem 1 lub 2 pz na 648 (0,15–0,30%), od szympansów o ok. 60 pz (9,26%), a od goryli o ok. 70 pz (10,8%). 

Królestwo roślin

W przeciwieństwie do zwierząt znalezienie odpowiedniej sekwencji do identyfikacji roślin było dużo trudniejsze i zajęło naukowcom niemalże 7 lat. Niskie tempo mutacji (substytucji) w genomie mitochondrialnym roślin wykluczało wykorzystanie sekwencji cox1 jako uniwersalnego barkodu dla roślin. Genom mitochondrialny u roślin jest najwolniej mutującą frakcją genomu, tempo podstawień nukleotydowych jest tu około 100 razy wolniejsze niż w mtDNA zwierząt. Odpowiedniej sekwencji naukowcy poszukiwali więc w genomie chloroplastowym, w którym zmiany mutacyjne zachodzą szybciej (średnie tempo mutacji synonimiczych w cpDNA jest 3 razy większe niż w roślin­nym mtDNA). Wstępna faza ­badań wyłoniła 7 rejonów z chloroplastowego genomu (loci), które zostały uznane przez Consortium for the Barcode of Life za potencjalne loci barkodowe dla roślin. Cztery z nich to rejony kodujące, czyli fragmenty genów: rbcL, matK, rpoB, rpoC1, i 3 niekodujące odcinki międzyge­nowe: atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI. Nad opracowaniem barkodów dla roślin pracowała Grupa Robocza ds. Roślin działająca w ramach Consortium, zaangażowanych było 52 naukowców z 9 krajów pod kierunkiem Petera Hollingswortha z Royal Botanical Garden 


Ryc. 3. Schemat obrazujący barcoding gap

w Edynburgu. Badane regiony DNA były testowane pod względem trzech kryteriów, które sekwencja musi wykazywać, aby mogła pełnić rolę barkodu: 

  1. Uniwersalności (łatwość amplifikacji i sekwencjonowania) w różnych grupach roślin przy użyciu tych samych starterów.
  2. Jakości uzyskanych sekwencji, czy sekwencję można odczytać z obu nici DNA (F i R) i automatycznie złożyć w sekwencję konsensusową (ryc. 2). 
  3. Siły dyskryminacyjnej, czyli jaki procent gatunków sekwencja pozwala odróżnić. Aby sekwencja będąca barkodem była skuteczna, powinna powstać przerwa, tzw. „barcoding gap”, pomiędzy zakresem zróżnicowania sekwencji wewnątrz gatunków a zróżnicowaniem między badanymi gatunkami (ryc. 3).

Spośród testowanych odcinków chlo­roplastowego DNA żaden pojedynczy odcinek nie spełniał wszystkich kryteriów barkodu ustalonych przez Konsorcjum. Wobec tego Grupa Robocza ds. Roślin zaproponowała kombinację dwóch odcinków: rbcL nazwanego kotwicą i matK określonego mianem identyfikatora, jako tak zwany rdzeń barkodu dla roślin, który w razie potrzeby może być uzupełniony o dodatkowe loci (sekwencje z innych rejonów DNA). Propozycja ta została zaakceptowana przez międzynarodowe Konsorcjum. Barkod rbcL obejmuje 599 pz (początkowy fragment genu rbcL kodującego dużą podjednostkę RUBISCO), natomiast barkod matK ok. 841 pz (centraly odcinek genu maturazy). Wybór ten uzasadniają: duża łatwość uzyskania sekwencji rbcL oraz duża siła dyskryminacyjna rejonu matK. Gen maturazy jest jednym z szybciej ewoluujących regionów kodujących chloroplastowego genomu. Jednak ampli­fikacja regionu matK w niektórych grupach roślin sprawia duże trudności. Kombinacja ta jest pragmatycznym kompromisem pomiędzy uniwersalnością, jakością sekwencji, siłą dyskryminacyjną, kosztami i nakładem pracy, gdyż należy podkreślić, że aby metoda znalazła powszechne zastosowanie, powinna być skuteczna, a jednocześnie nie powinna być zbyt droga i czasochłonna. Dodanie kolejnych sekwencji wydłuża czas badań i zwiększa koszty. Dane zebrane przez Grupę Roboczą ds. Roślin pokazują, że kombinacja dwóch loci (rbcL i matK) była wystarczająco skuteczna dla 75% badanych gatunków. W przypadku konie­czności zastosowania dodatkowych markerów jednym z proponowanych odcinków jako barkod uzupełniający jest niekodujący region pomiędzy genami trnH i psbA, jeden z bardziej zmiennych odcinków międzygenowych plastydowego DNA. 

W poszukiwaniach optymalnego barkodu dla roślin Chińska Grupa Konsorcjum powróciła w 2011 r. do odrzuconej pierwotnie przez Konsorcjum, z powodu pewnych wad jądrowych, sekwencji ITS (wewnętrzne sekwencje transkrybowane, ang. Internal Transcribed Spacer) obejmującej dwa niekodujące odcinki ITS1 i ITS2 zawarte między genami rDNA, które były wykorzystywane jako markery specyficzne gatunkowo w różnych grupach organizmów już od początku lat 90. Chińska Grupa przedstawiła argumenty popierające włączenie tej sekwencji jako uniwersalnego barkodu dla roślin. Wyniki badań przeprowadzone na dużej próbie roślin nasiennych dowodzą, że rejon ten jest dobrym dodatkowym barkodem. Spośród 4 testowanych loci (rbcL, matK, trnH-psbA, ITS) ITS wykazywał najwyższą siłę dyskryminacyjną, rozróżniając 67% gatunków, większą niż rdzeń barkodu rbcL + matK (49,7%), a dodanie ITS do rdzenia barkodu podwyższyło jego rozdzielczość do 82%. Tak więc korzyści z zastosowania jądrowego odcinka ITS1/ITS2 w zwiększeniu skuteczności przewyższają jego wady. Ponadto kombinacja markerów z dwóch genomów (c...

Pozostałe 70% treści dostępne jest tylko dla Prenumeratorów.

Co zyskasz, kupując prenumeratę?
  • 6 wydań czasopisma "Biologia w Szkole"
  • Dostęp do wszystkich archiwalnych artykułów w wersji online
  • ...i wiele więcej!
Sprawdź

Przypisy