Dołącz do czytelników
Brak wyników

Temat numeru

20 września 2018

NR 10 (Lipiec 2015)

ILE WIDZISZ RÓŻNIC? – markery genetyczne jako źródło informacji o organizmach

0 280

Jak porównać dwa gatunki albo jak sprawdzić, jak dziedziczą się ich cechy? Skąd czerpać informacje o organizmach żywych? Odpowiedź na wiele tego typu pytań uzyskać można dzięki analizie informacji genetycznej zawartej w genomach. W którym jednak miejscu w genomie szukać interesujących nas informacji? Naukowcy często wykorzystują w tym celu markery genetyczne, czyli różnego typu cechy organizmu pozwalające na określenie jego genotypu. 

Klasyfikacja markerów 

Biorąc pod uwagę typ analizowanej cechy, wyróżnić można markery molekularne, biochemiczne i morfologiczne (ryc. 1) [White i in. 2007]. Początkowo bazowano głównie na tych ostatnich, czyli cechach zewnętrznych organizmu. Historycznie ważne były też markery enzymatyczne służące do identyfikacji organizmów i do ich analizy genetycznej. Zastosowanie niektórych enzymów jest jednak ograniczone ze względu na niewielką liczbę dostępnych markerów, stosunkowo niski poziom polimorfizmu, a także zależność ich aktywności od środowiska, wieku czy stadium rozwojowego osobników (Lowe i in. 2004). 

Ogromnym przełomem i początkiem gwałtownego rozwoju biologii molekularnej był rok 1983, kiedy to kalifornijski naukowiec Kary Mullis opracował reakcję łańcuchową polimerazy, PCR (ang. polymerase chain reaction), za co później otrzymał Nagrodę Nobla. Technika ta pozwala na powielenie (amplifikację) interesującego nas fragmentu DNA, co umożliwia jego dalszą analizę, np. poprzez rozdzielanie i zobrazowanie fragmentów różnej długości na żelach elektroforetycznych. Obecnie na technice PCR bazuje większość analiz markerów genetycznych (tabela 1).

Cechy markerów genetycznych

Nie istnieje uniwersalny marker genetyczny. Użyteczność markerów zależy od typu prowadzonych badań. Przy doborze najdogodniejszego markera bierze się pod uwagę szereg cech, między innymi poziom polimorfizmu, sposób dziedziczenia, a także czas i koszty opracowania markera oraz jego analizy.

Poziom polimorfizmu jest jedną z najważniejszych cech markera genetycznego. Warianty markera powinny różnić się w sposób, który będzie łatwy do obserwacji i jednoznaczny do interpretacji. Mogą to być na przykład różnice w długości konkretnego odcinka DNA (insercje, delecje) lub zmiany pojedynczych nukleotydów (substytucje). 

Biorąc pod uwagę sposób dziedziczenia, markery podzielić można na kodominujące i dominujące. Za pomocą markerów kodominujących jesteśmy w stanie ustalić, czy dany osobnik jest homo- czy heterozygotą, czyli czy posiada dwa identyczne czy też różne allele w danym locus na chromosomach homologicznych. Markery dominujące ujaw­niają tylko dominującą formę alleliczną, w związku z czym nie pozwalają na odróżnienie heterozygoty od homozygoty. Naturalnie więc kodominacja jest pożądaną cechą markerów genetycznych. Jednakże markery te cechują się bardziej złożoną analizą.

Przy doborze markera i techniki jego analizy nie bez znaczenia są także względy ekonomiczne. Analizy molekularne są zwykle kosztowne. Mimo stałego spadku cen sekwencjonowania analiza większych rejonów genomu to wciąż wysoki wydatek. Szczególnie gdy eksperyment zakłada badanie dużej grupy osobników z wykorzystaniem wielu markerów, ważny jest wybór możliwie prostej, szybkiej i niedrogiej metody. Opracowuje się w tym celu tzw. techniki wysokoprzepustowe (ang. high-throughput screening, HTS), które dopuszczają analizę ogromnej liczby markerów jednocześnie. Przykładem takiej techniki są mikromacierze DNA, czyli malutkie płytki z fragmentami DNA, do których przyłączają się tylko komplementarne sekwencje, co sygnalizowane jest przez emisję fluorescencji. Mikromacierze pozwalające na przykład na jednorazowe genotypowanie milionów zmian pojedynczych nukleotydów (SNP-ów, czyt. snipów, ang. single nucleotide polymorphisms) [Cutler i in. 2001].

Markery genetyczne
Molekularne
(sekwencje DNA)
Biochemiczne
(białka, np. izoenzymy)
Morfologiczne
(np. barwa, kształt)

Ryc. 1. Klasyfikacja markerów genetycznych (według White’a i in. 2007)

Typ 
analizy
Analiza genomu Metoda analizy Marker genetyczny
całego wybranych fragmentów
niezależne od PCR + + RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) [Botstein i in. 1980] długości fragmentów DNA po trawieniu genomowego DNA enzymami restrykcyjnymi
+ + sekwencjonowanie sekwencja nukleotydowa
bazujące na PCR +   RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) [Williams i in. 1990] obecność fragmentów DNA po losowej 
amplifikacji
+   AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [Vos i in. 1995] długości powielonych fragmentów DNA
  + PCR – RFLP (Polymerase Chain Reaction – RFLP) długości fragmentów DNA po trawieniu 
produktu PCR enzymami restrykcyjnym
  + SSR (Simple Sequence Repeats) liczba powtórzeń kilku nukleotydów
+ + SNP (Single Nucleotide Polymorphism) pojedyncze nukleotydy
+   sekwencjonowanie sekwencja nukleotydowa

Tabela 1. Przykłady metod analizy markerów genetycznych

Metody analizy markerów molekularnych

Dostępnych jest wiele metod i technik analizy markerów genetycznych (tabela 1). Niektóre z nich pozwalają na analizę całego genomu, inne tylko wybranych jego fragmentów. Różne techniki oferują badaczom zróżnicowaną czułość i powtarzalność. Ważne jest, aby wyniki były powtarzalne pomiędzy różnymi laboratoriami i eksperymentami.  W przypadku gatunków rzadkich i chronionych istotna jest także niska inwazyjność przy pobieraniu materiału do badań. Wybiera się wtedy metody i techniki, w których wystarczająca jest niewielka ilość DNA, a jakość próby nie ma dużego wpływu na wynik.

Do markerów o największym znaczeniu ze względu na wysoki poziom polimorfizmu należą m.in. SNP-y, zmiany liczby tandemowych powtórzeń oraz bardziej złożone zmiany sekwencji nukleotydowych. 

Większe i złożone zmiany sekwencji DNA analizuje się przez sekwencjonowanie fragmentów genomu. Mogą do tego celu służyć zarówno rejony kodujące określone białko (eksony), jak i niekodujące (introny lub rejony międzygenowe). Fragmenty niekodujące są zwykle bardziej zmienne i pozwalają na iden­tyfikację osobnika, gatunku czy rodzaju. Fragmenty kodujące są konserwatywne, czyli ich sekwencje są często niezmienne pomiędzy blisko spokrewnionymi taksonami. Są one jednak użyteczne do badań systematycznych rodzaju lub rodziny.

Oprócz jądrowego DNA (nDNA) wykorzystuje się także markery ulokowane w  genomie mitochondrialnym (mtDNA) oraz (u roślin) chloroplastowym (cpDNA). Użyteczność poszczególnych genomów zależy od organizmu. U zwierząt mtDNA mutuje z o wiele większą częstością (średnio 56 x 10-9 substytucji/miejsce synonimiczne/rok) niż nDNA (3,5 x 10-9), podczas gdy u roślin jest odwrotnie – mtDNA ewoluuje najwolniej (0,36–0,50 x 10-9), cpDNA niewiele szybciej (0,86–1,20 x 10-9), natomiast nDNA cechuje najwyższy współczynnik mutacji (4,1–5,7 x 10-9) [Lowe i in. 2004]. Stąd właśnie często rejony mitochondrialne są wykorzystywane jako markery u zwierząt, natomiast u roślin wybierane są raczej rejony jądrowe i/lub chloroplastowe.

Zmiany pojedynczych nukleotydów pomiędzy osobnikami danego gatunku lub różnych gatunków (SNP-y, ryc. 2) powstają w wyniku mutacji punktowych i są największym źródłem zmienności genetycznej organizmów. Obecnie w bazie danych gromadzących informacje o SNP-ach ‒ NCBI dbSNP (www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) zdeponowanych jest już ponad 90 milionów polimorfizmów odkrytych u człowieka. Szacuje się, że w pojedynczym genomie ludzkim, zarówno w rejonach kodujących, jak i niekodujących, rozmieszczonych jes...

Pozostałe 70% treści dostępne jest tylko dla Prenumeratorów.

Co zyskasz, kupując prenumeratę?
  • 6 wydań czasopisma "Biologia w Szkole"
  • Dostęp do wszystkich archiwalnych artykułów w wersji online
  • ...i wiele więcej!
Sprawdź

Przypisy